Venenos de serpentes do gênero Bothrops: impacto da glicosilação na complexidade dos proteomas e função de toxinas / Bothrops snake venoms: impact of glycosylation on the complexity of proteomes and toxins function

A variabilidade estrutural é uma característica das proteínas de venenos de serpentes, e a glicosilação é uma das principais modificações pós-traducionais que contribui para a diversificação de seus proteomas. Recentes estudos de nosso grupo demonstraram que venenos do gênero Bothrops são marcadamente definidos pelo seu conteúdo de glicoproteínas, e que a maioria das estruturas de N-glicanos dos tipos híbrido e complexo identificados em oito venenos deste gênero contêm unidades de ácido siálico. Em paralelo, em glicoproteínas do veneno de B. cotiara foi identificada a presença de uma estrutura de N-acetilglicosamina bissecada. Assim, com o objetivo de investigar a variação do conteúdo de glicoproteínas, assim como os mecanismos envolvidos na geração dos diferentes venenos de Bothrops, neste estudo foram analisados comparativamente os glicoproteomas de nove venenos do gênero Bothrops (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi). As abordagens glicoproteômicas envolveram cromatografia de afinidade e ensaio de pull-down utilizando, respectivamente, as lectinas SNA (aglutinina de Sambucus nigra) e MAL I (lectina de Maackia amurensis), que mostram afinidade por unidades de ácido siálico nas posições, respectivamente, α2,6 e α2,3; e cromatografia de afinidade com a lectina PHA-E (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), que reconhece N-acetilglicosamina bissecada. Ainda, eletroforese de proteínas, blot de lectina, e identificação de proteínas por espectrometria de massas foram empregadas para caracterizar os glicoproteomas. As lectinas geraram frações dos venenos enriquecidas de diferentes componentes, onde as principais classes de glicoproteínas identificadas foram metaloprotease, serinoprotease, e L-amino ácido oxidase, além de outras enzimas pouco abundantes nos venenos. Os diferentes conteúdos de proteínas reconhecidas por essas lectinas, com especificidades distintas, ressaltaram novos aspectos da variabilidade dos subproteomas de glicoproteínas desses venenos, dependendo da espécie. Ainda, considerando que metaloproteases e serinoproteases são componentes abundantes nesses venenos e fundamentais no quadro de envenenamento botrópico, e que estas enzimas contêm diversos sítios de glicosilação, o papel das unidades de ácido siálico na atividade proteolítica das mesmas foi avaliado. Assim, a remoção enzimática de ácido siálico (i) alterou o padrão de gelatinólise em zimografia da maioria dos venenos, (ii) diminuiu a atividade proteolítica de alguns venenos sobre o fibrinogênio e a atividade coagulante do plasma humano de todos os venenos, e (iii) alterou o perfil de hidrólise de proteínas plasmáticas pelo veneno de B. jararaca, indicando que este carboidrato pode desempenhar um papel na interação das proteases com seus substratos proteicos. Em contraste, o perfil da atividade amidolítica dos venenos não se alterou após a remoção de ácido siálico e incubação com o substrato Bz-Arg-pNA, indicando que ácido siálico não é essencial em N-glicanos de serinoproteases atuando sobre substratos não proteicos. Em conjunto, esses resultados expandem o conhecimento sobre a variabilidade de proteomas de venenos do gênero Bothrops e apontam a importância das cadeias de carboidratos contendo ácido siálico nas atividades enzimáticas das proteases desses venenos

Structural variability is a feature of snake venom proteins, and glycosylation is one of the main post-translational modifications that contributes to the diversification of venom proteomes. Recent studies by our group have shown that Bothrops venoms are markedly defined by their glycoprotein content, and that most hybrid and complex N-glycan structures identified in eight venoms of this genus contain sialic acid units. In parallel, the presence of a bisected N-acetylglucosamine structure was identified in B. cotiara venom glycoproteins. Thus, with the aim of investigating the variation in the content of glycoproteins, as well as the mechanisms involved in the generation of different Bothrops venoms, in this study the glycoproteomes of nine Bothrops venoms (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi) were comparatively analyzed. The glycoproteomic approaches involved affinity chromatography and pulldown using, respectively, the lectins SNA (Sambucus nigra agglutinin) and MAL I (Maackia amurensis lectin), which show affinity for sialic acid units at positions, respectively, α2,6 and α2,3, and affinity chromatography with PHA-E (Phaseolus vulgaris erythroagglutinin), which recognizes bisected N-acetylglucosamine. In addition, protein electrophoresis, lectin blot, and protein identification by mass spectrometry were employed for glycoproteome characterization. The lectins generated venom fractions enriched with different components, where the main classes of glycoproteins identified were metalloprotease, serine protease, and L-amino acid oxidase, in addition to other low abundant enzymes. The different contents of proteins recognized by these lectins of distinct specificities highlighted new aspects of the variability of the glycoprotein subproteomes of these venoms, depending on the species. Furthermore, considering that metalloproteases and serine proteases are abundant components of these venoms and essential in Bothrops envenomation, and that these enzymes contain several glycosylation sites, the role of sialic acid units in their proteolytic activities was evaluated. Thus, enzymatic removal of sialic acid (i) altered the pattern of gelatinolysis in zymography of most venoms, (ii) decreased the proteolytic activity of some venoms on fibrinogen and the clotting activity of human plasma of all venoms, and (iii) altered the hydrolysis profile of plasma proteins by B. jararaca venom, indicating that this carbohydrate may play a role in the interaction of proteases with their protein substrates. In contrast, the profile of amidolytic activity of the venoms did not change after removal of sialic acid and incubation with the substrate Bz-Arg-pNA, indicating that sialic acid is not essential in N-glycans of serine proteases acting on small substrates. Together, these results expand the knowledge about the variability of proteomes of Bothrops venoms and point to the importance of carbohydrate chains containing sialic acid in the enzymatic activities of venom proteases

Uso do gérmen de milho desengordurado, com e sem adição de um complexo enzimático, em dietas para cães / [Use of defatted corngerm with and without the addition of an enzyme complex in dog diets]

Objetivou-se avaliar o coeficiente de digestibilidade aparente (CDA) dos nutrientes, a palatabilidade das dietas e as características fecais de cães alimentados com uma dieta controle e uma dieta contendo 20% de gérmen desengordurado (GD), com e sem adição de complexo enzimático (amilase, xilanase, betaglucanase e mananase). Para o experimento de digestibidade e das características fecais, foram utilizados 12 cães adultos, distribuídos em delineamento em blocos ao acaso, em esquema fatorial 2 x 2 (dieta x enzima). O segundo experimento avaliou a palatabilidade, por meio da primeira escolha e da razão de ingestão (RI) da dieta DC vs. 20% de GD, utilizando-se 16 cães. O teste de palatabilidade contou com três dias consecutivos, totalizando 48 repetições. A dieta com inclusão de 20% de GD teve os menores valores de CDA da MS, da EB e da EM (P<0,05). A inclusão do complexo enzimático melhorou o CDA da MS, da EB e da EM (P<0,05). Não foram observadas diferenças nas características fecais (P>0,05). Em relação à palatabilidade, os cães preferiram a dieta 20% de GD, tanto na primeira escolha como na RI (P<0,05). A inclusão de enzimas às dietas melhora a digestibilidade dos nutrientes e da EM, sendo um aditivo com potencial uso na alimentação de cães.(AU)

The objective was to evaluate the apparent digestibility coefficient (ADC) of nutrients, diet palatability and fecal characteristics of dogs fed diets containing degreased germ (DG), and a control diet (DC) - both with and without the addition of enzyme complex (amylase, xylanase, betaglucanase and mananase). For the digestibility and fecal characteristics experiment 12 adult dogs were used, distributed in a randomized block design, in a 2 x 2 factorial scheme (diet x enzyme). The second experiment evaluated palatability using the first choice and ingestion ratio (IR) of DC diet vs. 20%gD, using 16 dogs. The palatability test had three consecutive days, totaling 48 repetitions. The diet with inclusion of 20% DG had the lowest ADC values of DM, GE and ME (P <0.05). Inclusion of the enzyme complex improved ADC of DM, GE and ME (P <0.05). No differences in fecal characteristics were observed (P >0.05). Regarding palatability, dogs preferred the 20% DG diet in both first choice and IR (P <0.05). Inclusion of enzymes in diets improves nutrient digestibility and ME, being an additive with potential use in dog food.(AU)

Acrylamide reduces plasma antioxidant vitamin levels in rats due to increased oxidative damage / Acrilamida reduz os níveis de vitamina antioxidante no plasma em ratos devido ao aumento do dano oxidativo

ABSTRACT Objective Acrylamide is a potentially neurotoxic and carcinogenic chemical and naturally creates during the heating process of carbohydrate-rich foods, such as potato chips and breakfast cereals. Acrylamide might be ingested by people via consuming food that contains it. Therefore, we investigated the effect of acrylamidegiven orally to male and female rats on plasma retinoic acid and α-tocopherol and serum sialic acid and malondialdehyde levels. Method A total of 50 Wistar rats were used (25 female and 25 male, three-four weeks old). The rats of each sex were given 2 and 5mg/kg/day acrylamide via drinking water for 90 days. At the end of the treatment, the animals were euthanized by cervical dislocation. Blood specimens were collected through cardiac puncture, and serum and plasma samples were analysed using the high-performance liquid chromatography technique with a Ultraviolet detector. Results The analysis of the plasma and serum samples revealed that serum sialic acid and malondialdehyde levels in both sexes given 5mg/kg/day acrylamide were significantly increased, and the serum sialic acid levels were higher in female rats given 2mg/kg/day acrylamide. The plasma retinoic acid and α-tocopherol levels significantly decreased in both sexes given only the highest dose. Conclusion The results show that acrylamide causes an increase in oxidative stress and leads to a decrease in the levels of retinoic acid and α-tocopherol which play a role in the defense mechanism against this stress.

RESUMO Objetivo A acrilamida é um químico potencialmente neurotóxico e carcinogênico, sendo naturalmente criada durante o processo de aquecimento de alimentos ricos em carboidratos, como batatas fritas e cereais matinais. Dado que o composto pode ser ingerido através do consumo de alimentos, o presente trabalho teve por objetivo investigar o seu efeito, quando administrado oralmente a ratos, medindo-se os níveis plasmáticos de ácido retinoico e α-tocoferol, bem como os níveis séricos de ácido siálico e malondialdeído Métodos Foram utilizados cinquenta ratos Wistar, sendo metade de cada sexo, com idade entre três e quatro semanas. Os animais foram divididos em dois grupos, os quais receberam diferentes doses diárias de acrilamida, via água potável, durante noventa dias: o primeiro ingeriu 2mg/kg/dia; e o segundo, 5mg/kg/dia. Ao final do tratamento, os animais foram eutanasiados por meio de luxação cervical. Amostras de sangue foram coletadas através de punção cardíaca, assim como amostras de soro e plasma foram medidas usando-se a técnica de cromatografia líquida de alta performance com detector de Ultravioleta. Resultados A análise das amostras de plasma e soro revelou que os níveis de ácido siálico e malondialdeído, em ratos de ambos os sexos tratados com acrilamida de 5mg/kg/dia, foram significativamente aumentados, ao passo que os níveis séricos de ácido siálico foram maiores em ratas tratadas com 2mg/kg/dia de acrilamida. Já os níveis plasmáticos de ácido retinoico e α-tocoferol diminuíram significativamente em ratos de ambos os sexos, quando tratados com a dose mais elevada.Concl Conclusão Os resultados mostram que a acrilamida causa um aumento no estresse oxidativo e leva a uma diminuição nos níveis de ácido retinoico e α-tocoferol, que desempenham um papel no mecanismo de defesa contra esse estresse.

Hidratos de carbono complejos en la leche materna: los oligosacáridos (Parte 1) / Complex carbohydrates in breast milk: oligosaccharides (Part 1)

Los oligosacáridos de la leche materna (HMOs) son unas 200 moléculas distintas sintetizadas y secretadas por la glándula mamaria a partir de lactosa a la que diversos enzimas unen monosacáridos simples (glucosa, galactosa, n-acetil galactosamina, fucosa y ácido siálico). Estas uniones y sus diferentes orientaciones espaciales generan una gran diversidad de estructuras químicas y de funcionalidades. La concentración de los HMOs es mayor en el calostro (± 25 g/L), está relacionada con la duración del embarazo y la lactancia: disminuyen progresivamente hasta la mitad de los niveles iniciales. La genética materna influye en el perfil de algunos HMOs; el gen FUT2, que codifica la síntesis de la fucosiltransferasa 2 (FUT2) condiciona el llamado carácter secretor en 75-85% de las mujeres y hace que los antígenos del grupo ABO(H) sean secretados en los líquidos orgánicos (saliva, lágrimas, semen). La ausencia de actividad del gen FUT2 condiciona el carácter no-secretor (15-25% de las mujeres). La actividad del gen FUT3 condiciona la actividad de la fucosiltransferasa 3 (FUT3) que se asocia con el grupo sanguíneo Lewis+ mientras que su ausencia caracteriza a los portadores como Lewis 0. Los HMOs son absorbidos a nivel del intestino como trazas (1%) pero incluso en esas cantidades ejercerían efectos sistémicos.

Human milk oligosaccharides (HMOs) are a family of some 200 different molecules synthesized by the mammary gland. At the core is a molecule of lactose, which is linked by different enzymes to glucose, galactose, n-acetyl galactosamine, fucose or sialic acid. These linkages and their different spatial orientation generate, besides the possibilities of numerous chemical structures, the potential for different spatial isomers. The concentration of HMOs in human milk depends on pregnancy and breastfeeding duration. They are highest in colostrum (± 25 g/L) and decrease over time to half this initial level. Maternal genetics modifies the concentration and profile of some oligosaccharides. For example, the FUT2 gene codifies the synthesis of fucosyltransferase 2 (FUT2) whose activity generates the secretor status for antigens of the ABO(H) blood group in organic fluids (saliva, milk, tears, semen) among 75-85% of the carriers of the trait. The absence of activity of the FUT2 gene conditions the non-secretor status (15-25% of women). The FUT3 gene regulates the activity of the fucosyltransferase 3 (FUT3) that is associated with the Lewis blood group. Traces of HMOs (1%) are absorbed in the intestinal tract, however, they exert important systemic effects even at low concentrations.

Alteración del ácido siálico eritrocitario por efecto de Trichinella spiralis aplicando el método de Azul Alcian / Alteration of erythrocyte sialic acid by the effect of Trichinella spiralis applying the Alcian Blue method / Alteração do ácido siálico eritrocitário por efeito da Trichinella spiralis aplicando o método de Alcian Blue

Actualmente se reconoce que los ácidos siálicos están involucrados en múltiples funciones biológicas y que tienen un papel importante en la interacción parásito-hospedador. El objetivo del trabajo fue estudiar la alteración del ácido siálico eritrocitario por efecto de T. spiralis aplicando el método de Azul Alcian. Se trabajó con 11 concentrados de larvas musculares de T. spiralis (LM) y 9 de larvas recién nacidas de T. Spiralis (LRN) (total: 20) y con suspensiones de eritrocitos frescos. Se realizó el tratamiento incubando el sedimento globular con igual volumen de concentrado larval (37 ºC durante 1 hora). Los controles fueron incubados de la misma forma con solución salina. Se aplicó el método de Azul Alcian y se determinó CAE% en el control y en los glóbulos tratados. Se calculó CexpCAE. Los resultados mostraron que 5/9 de los concentrados de LRN y 9/11 de LM modificaron la carga globular. La media y la desviación estándar de los CexpCAE de las suspensiones en que la carga disminuyó por contacto con LRN y LM, fueron 0,614±0,1946 y 0,656±0,1865 respectivamente, mientras que en las que no se modificó resultó 0,955±0,0289 en el tratamiento con LRN y 0,93±0,0141 con LM. Se concluye que el Método de Azul Alcian es útil para estudiar las variaciones en la carga eritrocitaria por efecto de LRN y LM de T. spiralis.

It is now recognized that sialic acids are involved in multiple biological functions and that they have an important role in the parasite-host interaction. The objective of this work was to study the alteration of erythrocyte sialic acid by the effect of T. spiralis applying the Alcian Blue method. Work was carried out with 11 larval concentrates of ML and 9 of NL (total 20) and with fresh erythrocyte suspensions. The treatment was performed incubating the globular sediment with equal volume of larval concentrate (37 °C for 1 hour). The controls were incubated in the same way with saline solution. The Alcian Blue method was applied and CAE% was determined in the control and in the treated globules. CexpCAE was calculated. The results showed that 5/9 of the NL concentrates and 9/11 of ML modified the globular charge. The mean and standard deviation of the CexpCAE of the suspensions in which the charge decreased by contact with NL and ML were 0.614±0.1946 and 0.656±0.1865 respectively, whereas in those that did not change, it was 0.955±0.0289 in the NL treatment and 0.93±0.0141 in the ML. It is concluded that the Alcian Blue Method is useful to study the variations in erythrocyte charge due to NL and ML of T. spiralis.

Atualmente se reconhece que os ácidos siálicos estão envolvidos em múltiplas funções biológicas e que têm um papel importante na interação parasita-hospedeiro. O objetivo do trabalho foi estudar a alteração do ácido siálico eritrocitário por efeito de T. spiralis aplicando o método do Alcian Blue. Trabalhou-se com 11 concentrados de larvas musculares de T. spiralis (LM) e 9 de larvas recém-nascidas de T. Spiralis (LRN) (total: 20) e com suspensões de eritrócitos frescos. Realizou-se o tratamento incubando o sedimento globular com igual volume de concentrado larval (37 ºC durante 1 hora). Os controles foram incubados da mesma forma com solução salina. Aplicou-se o método de Azul Alcian e determinou-se CAE% no controle e nos glóbulos tratados. Calculou-se CexpCAE. Os resultados mostraram que 5/9 dos concentrados de LRN e 9/11 de LM modificaram o carga globular. A média e o desvio padrão dos CexpCAE das suspensões em que a carga diminuiu por contato com LRN e LM, foram 0,614±0,1946 e 0,656±0,1865 respectivamente, enquanto que naquelas onde não se modificou, resultou 0,955±0,0289 no tratamento com LRN e 0,93±0,0141 com LM. Conclui-se que o método de Alcian Blue é útil para estudar as variações na carga eritrocitária por LRN e LM de T. spiralis.

Captación de ácido siálico por larvas musculares de Trichinella spiralis durante incubación in vitro / Sialic acid capture by Trichinella spiralis muscle larvae during incubation in vitro / Captação de ácido siálico por larvas musculares de Trichinella spiralis durante a incubação in vitro

Se ha comunicado que los eritrocitos (GR) incubados in vitro con larvas infectantes (LM) de T. spiralis presentan mayor agregación que los GR Controles incubados con solución salina, lo que indica que el parásito capta el ácido siálico globular. El objetivo del trabajo fue estudiar la captación de ácido siálico por LM durante incubación in vitro. Se incubaron 30, 60, 90 y 180 larvas con 30 mL del sedimento de GR en 1 mL de solución salina durante 24 y 48 h (37 °C). Se aplicó el Método de Agregación por Polibrene y se calculó Tïtulo, Score Total y CexpCASP. Los resultados mostraron una disminución significativa de estos 3 valores en relación al Control, excepto en el cultivo con 30 LM donde solo se observó un descenso moderado del Score Total y CexpCASP. La captación fue máxima a las 24 h, sin diferencias con los valores obtenidos a las 48 h. Posteriormente se incubaron 60 LM durante 1, 2 y 3 h. Se observó que no hubo captación de ácido siálico en la primera hora de incubación y que fue moderada a las 3 h. La experiencia demostró la captación de ácido siálico globular por las LM in vitro, lo que sugiere que podrían secuestrarlo del miocito con el objeto de evadir y/o interferir la respuesta inmune a los fines de asegurar su permanencia en el hospedador.

It has been reported that erythrocytes (RBC) incubated with infective larvae of T. spiralis (ML) exhibit higher aggregation than Control RBC incubated with saline solution, indicating that the parasite captures erythrocyte sialic acid. The objective of this work was to study sialic acid capture by ML during in vitro incubation. A total of 30, 60, 90 and 180 larvae were incubated with 30 mL of GR sediment in 1 mL of saline solution for 24 to 48 hours (37 °C). Aggregation by Polybrene Method was used, and Titre, Total Score and CexpCASP were calculated. The results showed a significant decrease of these three values compared to Control except in the culture with 30 ML where only a moderate decrease of Total Score and CexpCASP were observed. The capture was maximal at 24 hours, with no difference with the values obtained at 48 hours. Then, 60 ML were incubated for 1, 2 and 3 hours. It was noted that ML did no capture sialic acid in the first hour of incubation and the capture was moderate at 3 hours. The experience showed globular sialic acid capture by ML in vitro, suggesting that they could sequester it from the myocyte in order to evade and/or interfere with the immune response for the purposes of assuring their permanence in the host.

Foi informado que os eritrócitos (GV) incubados in vitro com larvas infetantes (LM) da T. spiralis apresentam maior agregação que os GV Controles incubados com solução salina, indicando que o parasita capta o ácido siálico globular. O objetivo do trabalho foi estudar a captação de ácido siálico por LM durante a incubação in vitro. Foram incubadas 30 , 60 , 90 e 180 larvas com 30 μL do sedimento de GV em 1 mL de solução salina durante 24 a 48 horas (37 °C). Foi aplicado o Método de Agregação por Polibrene e se calculou o Título, Pontuação Total e CexpCASP. Os resultados mostraram uma diminuição significativa desses três valores em relação ao Controle, exceto na cultura com 30 LM, onde foi observada apenas uma redução moderada da Pontuação Total e CexpCASP. A captação foi máxima às 24 horas, sem diferença com os valores obtidos às 48 horas. Posteriormente 60 LM foram incubadas durante 1, 2 e 3 horas. Observou-se que não houve captação alguma de ácido siálico na primeira hora de incubação e que foi moderada às 3 horas. A experiência mostrou captação de ácido siálico globular pelas LM in vitro, sugerindo que poderiam sequestrá-lo do miócito visando a evadir e/ou interferir a resposta imune, para garantir sua permanência no hospedeiro.

Proteólise da κ-caseína em leite e bebida láctea UAT durante o período de validade comercial / κ-casein proteolysis during the shelf-life of UHT milk and milk beverage

A proteólise do leite e da bebida láctea UAT durante a estocagem é um dos fatores mais importantes na determinação da validade comercial desses. O teor de glicomacropeptídeos (GMP) é um marcador das ações proteolíticas no leite, pois é capaz de indicar indiretamente a integridade da κ-caseína. Assim, no presente trabalho, objetivou-se avaliar a proteólise da κ-caseína do leite e da bebida láctea UAT ao longo do período de validade. Foram avaliadas 60 amostras de cinco diferentes marcas comerciais de cada produto através do método espectrofotométrico para quantificação de ácido siálico. Para o leite UAT foi observado o intervalo entre 3,83 e 15,27 µg de ácido siálico/mL no início do período de validade (D0), 5,95 a 17,16 µg de ácido siálico/mL 60 dias após o início do período (D60) e 6,54 a 21,11 µg de ácido siálico/mL no final do período, ou seja, 120 dias após (D120) a produção. Já para as bebidas lácteas foram observados intervalos entre 11,12 e 24,25; 15,74 e 24,73 e 17,19 e 26,49 µg de ácido siálico/mL para o dia inicial, 60 e 120 dias do período de validade, respectivamente. Os valores obtidos para o índice proteolítico do leite e bebida láctea UAT aumentaram gradativamente ao longo do período de validade dos produtos, sendo tal diferença detectável a partir de sessenta dias. Não foi observada influência da abertura da embalagem na proteólise da k-caseína.

The UHT milk and milk beverage proteolysis during storage is the major factor that limits the shelf-life of these products. The GMP content has assumed importance because it can indirectly indicate the integrity of κ-casein in milk. So, this study focused on evaluates the κ-casein proteolysis in UHT milk and milk beverage during the shelf-life. 60 samples obtained of five different brands of each product were evaluated by spectrophotometric assay for quantifying acid sialic. For UHT milk was observed the values ranging from 3.83 to 15.27 µg acid sialic/ml at the begin of the shelf-life, from 5.95 to 17.16 mg sialic acid/ml at the middle of the period (60 days after the production) and 6.54 to 21.11 mg sialic acid/ml at the end of shelf-life (120 days). For milk beverages were observed ranges between 11.12 to 24.25, 15.74 to 24.73 µg of sialic acid/ml and from 17.19 to 26.49 mg sialic acid/ml respectively for the beginning, 60 and 120 days of the shelf-life. The proteolysis rate in UHT milk and milk beverage increased during the shelflife and is detectable after 60 days of the shelf-life. The practice of open the package did not influence the κ-casein proteolysis.

Acción biorreológica de extractos de Ascaris lumbricoides en eritrocitos humanos / Biorheological activity of Ascaris lumbricoides extracts in human erythrocytes

Experiencias previas han reportado que los extractos de A. lumbricoides captan ácido siálico del eritrocito humano modificando su carga. El objetivo fue evaluar in vitro las posibles alteraciones biorreológicas debidas al efecto de extractos del parásito adulto. Se analizó la acción de 8 extractos sobre eritrocitos Grupo O, incubando el sedimento globular con igual volumen de extracto y con PBS. Se determinó la distribución y morfología de los agregados (Análisis Digital de Imágenes), carga porcentual (método Azul de Alcian), cinética de agregación (eritroagregámetro) y viscoelasticidad (eritrodefórmetro). Los resultados mostraron que todos los extractos causaron una disminución del porcentaje de células aisladas y un aumento en el tamaño de los agregados, sin alterar su morfología. Los glóbulos tratados con 6 extractos mediaron una significativa alteración de la carga superficial y con 5 de ellos la velocidad de agregación fue menor que en el control. Se observó una correlación lineal entre los parámetros de cinética y la concentración proteica de los extractos. Uno de los tratamientos modificó la fluidez de membrana y dos disminuyeron la deformabilidad eritrocitaria, pero ninguno afectó la elasticidad. Estas experiencias in vitro permiten concluir que el contacto de los extractos con los eritrocitos produce alteraciones hemorreológicas.

Previous studies have reported that A. lumbricoides extracts capture sialic acid from human erythrocytes, modifying their charge. The purpose was to evaluate in vitro the possible biorheological alterations due to the effect of extracts from adult parasites. The activity of 8 extracts over Group O erythrocytes was analyzed incubating the globular sediment with an equal volume of extract and with PBS. The distribution and morphology of the aggregates was determined (Digital Image Analysis), percent of charge (Alcian Blue method), aggregation kinetics (erythroaggregameter), and visco-elasticity (erythroderformeter). The results showed that all the extracts produce a decrease of the percentage of isolated cells and an increase of the size of aggregates, without altering their morphology. Red cells treated with 6 extracts mediated a significant alteration of their superficial charge and with 5 of them the aggregation velocity was less than that of the control. A lineal correlation between the kinetic parameters and the protein concentration of the extracts occurred. One of the treatments modified the fluidity of the membrane and two decreased erythrocyte deformability, but none of them affected elasticity. These in vitro experiences allowed concluding that contact of the extracts with the erythrocytes produces hemorheological alterations.

Alteración de la carga eritrocitaria utilizando el método de azul Alcian en extractos de Ascaris lumbricoides / Change of erythrocyte charge with the use of Alcian blue method in Ascaris lumbricoides extracts

Introducción: el estudio de las interacciones hospedador-parásito es un nuevo desafío para comprender aspectos del metabolismo parasitario, los mecanismos de invasión, escape inmunológico y daño. Ascaris lumbricoides puede provocar anemia y trombosis. Previamente se demostró que este parásito altera la carga superficial eritrocitaria, lo cual indica que puede captar ácido siálico del glóbulo rojo. Objetivo: estudiar el efecto producido por extractos del parásito adulto sobre la carga eritrocitaria, utilizando el método de azul Alcian y comparar su sensibilidad con el método de Polibrene. Métodos: se trabajó con 55 extractos parasitarios [EA] y con suspensiones de eritrocitos grupo O. Se realizó el tratamiento de los glóbulos incubando el sedimento con igual volumen de [EA] a 37 ºC durante 1 h. El Control (eritrocitos sin contacto con [EA]) fue incubado con tampón fosfato pH 7,4. Se aplicó el método de azul Alcian y se determinó la carga aniónica eritrocitaria porcentual (CAE por ciento) en el Control y en los glóbulos tratados. Se definió el coeficiente experimental de carga aniónica eritrocitaria (Cexp CAE), como el cociente entre CAE por ciento final e inicial. Resultados: se observó que 27 de los 55 [EA] (49,1 por ciento) modificaron la carga de los glóbulos rojos, el Cexp CAE para estos eritrocitos resultó 0,75 ± 0,1144 y para los que no mostraron variación de carga de 0,94 ± 0,04450. El análisis estadístico concluyó que los métodos de Polibrene y de azul Alcian tienen sensibilidades comparables (p> 0,20). Conclusiones: Ascaris lumbricoides es capaz de captar ácido siálico del eritrocito, lo que contribuiría a explicar la trombosis atribuida al parásito, pero también sugeriría que el nematodo lo podría utilizar en sus rutas metabólicas o en sus estrategias de evasión inmunológica.

Introduction: the study of the host-parasite interactions is a new challenge to understanding some aspects of the parasitic metabolism and the mechanisms of invasion, immunological evasion and damage. Ascaris lumbricoides may cause anemia and thrombosis. It was previously shown that Ascaris lumbricoides modified the superficial charge of erythrocytes, which means that the parasite can capture sialic acid from the red blood cell. Objective: to study the effect of adult parasite extracts on the erythrocyte charge using the Alcian Blue method and to compare its sensitivity with the Polybrene method. Methods: fifty five adult parasite extracts and Group O erythrocyte suspensions were used. The erythrocytes were treated by incubating the sediment with an equal volume of parasite extracts for one hour at 37 ºC. The control group (erythrocytes without any contact with the parasite extracts) was incubated with pH 7.4phosphate buffer solution. Alcian Blue method was applied and the percentage erythrocyte anionic charge was determined in the control group and in the treated red cells. The experimental coefficient of erythrocyte anionic charge was defined as the quotient between the initial and the final percentage erythrocyte anionic charge. Results: it was shown that 27 out of 55 parasite extracts (49.1 percent) modified the charge of the red blood cells, being their experimental coefficient of the erythrocyte anionic charge 0.75 ± 0.1144 whereas the same coefficient amounted to 0,94 ± 0.0445 for those which did not show any charge variation. The statistical analysis concluded that the Polybrene and Alcian Blue Methods had comparable sensitivities (p>0.20). Conclusions: A. lumbricoides is able to capture sialic acid from the erythrocyte, which would not only explain the thrombosis attributed to the parasite, but also suggest that the nematode could use this acid either in its metabolic routes or for its strategies of immunological evasion.

Captación de ácido siálico por larvas de Ascaris lumbricoides durante incubación in vivo / Sialic acid capture by Ascaris lumbricoides larvae during in vivo incubation / Captação de ácido siálico por vermes de Ascaris lumbricoides durante incubação in vivo

La agregación eritrocitaria afecta la microcirculación y su estudio es importante en las vasculopatías. Se comunicó que Ascaris lumbricoides puede capturar ácido siálico (AS) del eritrocito y alterar la carga aniónica del glóbulo. El objetivo de este trabajo fue estudiar la captación de AS por larvas de A. lumbricoides incubadas in vivo con eritrocitos. Se trabajó con un concentrado de larvas ([CLAL]) incubado en 4 tubos con buffer fosfato y antibióticos. En dos se agregaron eritrocitos Grupo O. Los restantes fueron controles. Se incubaron a 37 °C (5% CO2) durante 24 y 48 horas. Las larvas fueron separadas, recolectadas, concentradas y contadas microscópicamente (larvas/mL: [CLAL]1: 1500-1700; [CLAL]3 1600-1800; [CLAL]2 y 4: 200400). Se utilizaron las técnicas de Inhibición de la Agregación por Polibrene (IAP) y Alcian Blue (AB). La IAP mostró una diferencia significativa entre los Títulos de Polibrene diluido en solución fisiológica y en [CLAL]1 y 2 que fueron incubados con eritrocitos 24 y 48 horas respectivamente. No hubo variación en el Título de los Controles correspondientes ([CLAL]3 y [CLAL]4). AB realizada en [CLAL]1 y [CLAL]3, determinó CASCap%= 6,65% ± 0,36 y CAS[CLAL]3% = 0,67% ± 0,36. La experiencia demostró la captación de AS por las larvas incubadas in vivo con eritrocitos y sugirió que ellas no presentan AS intrínseco. El secuestro de AS durante la migración larvaria podría ser importante en la interacción parásito-hospedador.

Erythrocyte aggregation affects microcirculation and its study is important in vascular diseases. It was communicated that Ascaris lumbricoides can capture erythrocyte sialic acid (SA) and alter the anionic charge on the red cell. The aim of this work was to study SA capture by A. lumbricoides larvae incubated in vivo with erythrocytes. Work was performed with concentrated larvae ([ALLC]) incubated in 4 tubes with phosphate buffer and antibiotics. Group O erythrocytes were added in two Tubes. The remaining were Controls. They were incubated at 37 °C (5% CO2) for 24 and 28 hours. The larvae were separated, collected, concentrated and counted microscopically (larvae/mL: [ALLC]1:1500-1700; [ALLC]3: 1600-1800; [ALLC]2 and 4: 200- 400). Aggregation Inhibition by Polybrene (AIP) and Blue Alcian (BA) techniques were used. AIP showed a significant difference between Polybrene Titers diluted with physiological solution and with [ALLC]1 and 2, which were incubated with erythrocytes 24 and 48 hours respectively. There was no change in the Title of the corresponding Controls. BA performed in [ALLC]1 and [ALLC]3 determined CapSAC = 6.65% ± 0.36 and SAC[CLAL]3 %= 0.67% ± 0.36. The experience showed SA capture by larvae incubated in vivo with erythrocytes and it suggested that they have no intrinsic SA. SA kidnapping during the larval migration could be important in parasite-host interaction.

A agregação eritrocitária afeta a microcirculação e seu estudo é Importante nas vasculopatias. Foi comunicado que o Ascaris lumbricoides pode capturar ácido siálico (AS) do eritrocito e alterar a carga aniônica do glóbulo. O objetivo deste trabalho foi estudar a captação de AS por vermes de A. lumbricoides incubados in vivo com eritrocitos. Trabalhouse com uma concentração de larvas ([CLAL]) incubada em 4 tubos com buffer fosfato e antibióticos. Em dois foram agregados eritrocitos Grupo O. Os restantes foram controles. Foram incubados a 37 °C (5% CO2) durante 24 e 48 horas. As larvas foram separadas, coletadas, concentradas e contadas microscopicamente (larvas/mL: [CLAL]1: 1500-1700; [CLAL]3 1600-1800; [CLAL]2 e 4: 200-400). As técnicas utilizadas foram de Inibição da Agregação por Polybrene (IAP) e Alcian Blue (AB). A IAP mostrou uma diferenga significativa entre os Títulos de Polybrene diluido em solução fisiológica e em [CLAL]1 e 2 que foram incubados com eritrocitos 24 e 48 horas respectivamente. Näo houve variação no Título dos Controles correspondentes ([CLAL]3 e [CLAL]4). AB realizada em [CLAL]1 e [CLAL]3, determinou CASCap%= 6,65% ± 0,36 e CAS[CLAL]3% = 0,67% ± 0,36. A experiencia demons-trou a captação de AS pelos vermes incubados in vivo com eritrócitos e sugeriu que eles näo apresentam AS intrínseco. O sequestro de AS durante a migração de larvas poderia ser importante na interação parasita-hospedeiro.

Alteraciones bioquímicas en individuos expuestos al arsénico en el agua de bebida en Tucumán, Argentina / Biochemical alterations in individuals consuming high levels of arsenic in drinking water in Tucuman, Argentina

El objetivo de esta investigación fue evaluar los niveles del ácido siálico (S) y enzimas hepáticas en individuos que consumieron agua con arsénico (As) relacionándolos con la presencia ("I con H") o no de hepatomegalia ("I sin H"). Se incluyeron 200 individuos, 85 correspondieron al Grupo Control (GC), 32 "I con H" y 83 "I sin H" quienes habían consumido agua con niveles mayores a 0,01 mg/L. Se les tomó una muestra de sangre venosa y se les realizó el dosaje del S y de las enzimas alaninaninotransferasa (ALT), aspartatoaminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (FAL), gamma glutamil transferasa (GGT), bilirrubina directa (BD) y total (BT), lactato deshidrogenasa (LDH) y 5' nucleotidasa (5'Nu). En los individuos que consumieron agua contaminada se encontró un aumento de los niveles del S. En el grupo "I con H", la FAL, la GGT y la LDH se encontraron aumentadas. En el grupo "I sin H", la GGT y la LDH tuvieron niveles elevados. En los individuos expuestos al As, no se encontraron alteraciones en los otros parámetros bioquímicos estudiados y la prevalencia de hepatomegalia no fue significativa. Los cambios bioquímicos encontrados fueron compatibles con la presencia de un patrón colestásico. Estos datos muestran que la concentración del S sérico podría servir como un indicador de exposición al arsénico que podría ser utilizado en forma conjunta con otros marcadores.

The aim of this study was to investígate the relationship between the levels of serum sialic acid (S) and hepatic enzymes in individuáis who drink As contaminated water. Two hundred individuáis were selected: 85 were the control group, 32 presented hepatomegaly (I with H) and 83 did not present hepatomegaly (I without H) who had consumed drinking water containing As levels higher than O.Ol mg/L. Blood samples were collected for the determination of S and hepatic enzymes in serum: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (FAL), gamma glutamil transpeptidase (GGT), direct (BD) and total bilirrubin (BT), lactate deshydrogenase (LDH) and 5'nucleotldase (5'Nu). The populatlon exposed to As in drinking water presented high levels of S, FAL, GGT, LDH and GGT, LDH were increased in I with H and I without H respectively. No significant changes were observed in the other parameters studied. Prevalence of hepatomegaly was not significantly higher and the hepatic biochemical changes were related with the presence of cholestasis in As-exposed people. These data show that people with high As level intake would have an increased sialoprotein replacement which could be an marker with other one of the alterations caused by arsenic.

Ácido siálico sérico, carga aniónica y agregación eritrocitaria en pacientes diabéticos e hipertensos / Serum sialic acid, cellular anionic charge and erythrocyte aggregation in diabetic and hypertensive patients

El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación del ácido siálico sérico (AS) y la carga aniónica eritrocitaria (CAE) con la agregación eritrocitaria en dos grupos de pacientes: diabéticos (DBT n= 20) e hipertensos (HTA n= 21), comparados con un grupo control (n= 20). Se trabajó con sangre anticoagulada con EDTA y suero. La agregación eritrocitaria se estudió por observación microscópica de los agregados y cuantificación a través de un parámetro de forma denominado ASP (Aggregation Shape Parameter). La CAE se determinó por unión a colorante alcian blue y el AS por método espectrofotométrico con reactivo de Erlich. Los valores de ASP y AS resultaron significativamente aumentados en los HTA y DBT respecto de los normales. Los HTA y DBT presentaron agregados amorfos, lo que se refleja en los valores alterados de ASP, significativamente mayores (p < 0.005) respecto de los individuos normales. Los valores de CAE resultaron significativamente inferiores en los HTA y DBT respecto del grupo control (p < 0.0001). En este trabajo se demostraron anormalidades en la agregación eritrocitaria, detectadas por los valores de ASP, CAE y AS que podrían estar involucradas en las complicaciones vasculares de vasculopatías como la hipertensión y la diabetes.

The aim of this work was to study the relationship between serum sialic acid (SSA) and erythrocyte anionic charge (EAC) with erythrocyte aggregation in two groups: diabetic (DBT, n=20) and hypertensive (HT, n=21) patients, compared to a control group (n=20). We worked with anticoagulated blood with EDTA and serum. The erythrocyte aggregation was studied by microscopically observing and quantifying aggregates using an ASP (Aggregate Shape Parameter). The EAC was determined by binding an Alcian blue dye to the membrane sialic acid and SSA was determined by spectrophotometric method with an Erlich reactant. The values of ASP and SSA increased significantly in HT and DBT patients compared to the control group. The HT and DBT groups showed amorphous aggregates, evident in an alteration in the values of ASP, which were significantly higher ( p< 0.005) than in healthy patients. The EAC values were much lower in HT and DBT patients than in the control group (p < 0.0001). In this work, abnormalities in the erythrocyte aggregation could be detected by the values of ASP, EAC and SSA, which might be involved in vascular disorders of diseases such as hypertension and diabetes.